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        香菇多糖研究進展
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            糖類的研究已有百余年的歷史,近20多年來,隨著膜的化學功能,免疫物質的化學研究的進展以及探尋新藥物資源的不斷拓展和研究的深入,發現糖類在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結構材料,更重要的是還參與了生命現象中細胞的各種活動,具有多種多樣的生物學功能。多糖一般由十個分子以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物。多糖按來源大致可分為植物多糖、動物多糖、海藻多糖、微生物多糖即細菌多糖和真菌多糖等。其中,具有很強生物活性的真菌多糖的研究日益受到重視,真菌多糖從真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離,是一類可以控制細胞分裂分化、調節細胞生長和衰老的活性多糖。真菌多糖作為藥物研究始于20世紀50年代,在60年代以后成為免疫促進劑受到廣泛關注,其中香菇多糖(1entinan,LNT)是研究得較透徹的多糖之一。

            香菇[Lentinus edodes(Berk.)Sing]為擔子菌綱傘形科真菌,是世界名貴食用菌兼藥用菌之一。1968年日本千原吳郎首先利用熱水從香菇子實體中浸提出6種胞外多糖,1970年Chihard和Sasaki用熱水浸提結合有機溶劑沉淀從香菇中提取到另外4種多糖,20世紀80年代以來,LNT的研究受到廣泛的重視,取得了一系列進展。

        1  香菇多糖的分子結構和理化性質

        1.1結構

            有關香菇多糖的成分和結構報道甚多,但已明確結構與免疫活性關系的只有β一葡聚糖物質。該多糖的一級結構具有β-(1→3)連接的吡喃葡聚糖主鏈,在主鏈中葡萄糖的c6位上含有支點(每5個葡萄糖有2個支點),其側鏈是由β-(1→6)鍵和β-(1→3)鍵相連的葡萄糖聚合體組成,在側鏈上也含有少數內部β-(1→6)鍵(圖1)。x.射線衍射分析證明,其立體結構為右旋三重螺旋的六方晶系,晶格常數a=b=1.5 nm,c=0.6 nm。采用高分辨13C-核磁共振(13CNMR)研究表明,其二級結構為凝結型的單螺旋構象。Sureniav~3j等從4種香菇中分離出的4種高分子抗腫瘤活性多糖,經檢測都是(1→3)-β-D-葡聚糖,并含有4.6%~15.2%的蛋白質。但4種多糖分別被破壞了三螺旋(1→3)-β-D-構型、被超聲波打成碎片、被除去結合蛋白質后,檢測它們的抗腫瘤活性,發現比天然物質有所降低。這就表明,多糖的構型、相對分子質量及結合蛋白質也可能影響其抗腫瘤活性。


        1.2理化性質

            香菇多糖為白色或棕黃色粉末,對光和熱穩定,具吸濕性,相對分子質量較大,無甜味和還原性,部分能溶于水,在水中的溶解度隨分子質量增大而降低,水溶液為中性,不溶于甲醇、已醇、丙酮等有機溶劑。

        2  香菇多糖的生物活性

        2.1免疫調節作用

            香菇多糖的免疫調節活性是其生物活性的重要基礎。香菇多糖是典型的T細胞激活劑,體內外均能促進細胞毒T淋巴細胞(cTL)的產生,提高CTL的殺傷活力,增強正;蛎庖吖δ艿拖滦∈蟮倪t發型超敏反應(DTH),提高抗體依賴性細胞毒細胞(ADDC)活性。Oka等通過體外香菇多糖與宿主細胞共培養,流式細胞儀免疫熒光檢測,研究香菇多糖免疫調節活性的觸發機制,結果發現多數香菇多糖能結合到人單核細胞上,認為香菇多糖結合到人單核細胞上可能是其影響免疫系統的首要因素。

        2.2抗腫瘤作用

            香菇多糖能有效預防化學性或病毒性腫瘤的發生,對小鼠S180實體瘤的抑制率高達70%~100%,其中90%小鼠的腫瘤完全消退;還能抑制化學致癌劑3一甲蔥酮的致癌作用,防止小鼠腸潰瘍惡化導致的結腸癌的發生。作為免疫輔助藥物,香菇多糖與化療劑聯合使用有減毒增效的作用,主要被用來抑制腫瘤的發生、發展與轉移,通過免疫調節作用或影響一些關鍵酶的活性來提高腫瘤對化療藥物的敏感性,改善患者的身體狀況,延長其壽命。

            香菇多糖在治療胃癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌等方面具有良好的療效,能夠延長腫瘤患者的存活時間,特別是胃癌和結腸直腸癌。目前香菇多糖抗腫瘤活性的機理還沒有完全搞清楚,但香菇多糖的免疫調節功能是抗腫瘤活性的基礎這一點得到了一致的認可。

        2.3抗感染作用

            據資料報道,香菇多糖可用于治療結核桿菌感染,能使耐藥性結核病人痰菌轉陰,病人外周血嗜中性粒細胞吞噬活性增加。香菇多糖還能延長李司忒氏菌感染小鼠的生存時間,這與其提高巨噬細胞功能有關,其抗感染的機制與多糖本身的特性有關。

            香菇多糖的作用機理可能是多糖分子表面與病原體表面發生粘附作用,阻截了病原體與正常細胞表面糖分子的結合,從而阻斷其感染途徑。硫酸化香菇多糖具有顯著抗HIV作用,體外10 mg/L就能完全抑制HIV抗原的表達,其作用機理可能是干擾HIV對宿主細胞的粘附作用,抑制逆轉錄酶的活性。

        2.4其他功能

            香菇多糖可以增強機體的排毒能力,降低由CCl4升高的血清轉氨酶活性,刺激被切除部分肝的老鼠的殘留肝再生,增強對洋地黃毒素的抵抗能力。香菇多糖藥用功效多樣,除上述外,還可以降血脂、抗衰老、抗病毒等。

        3  臨床應用

            動物實驗和體外實驗研究顯示,香菇多糖雖無直接的細胞毒副作用,但可激活多種活性免疫細胞如T細胞、NK細胞,使動物腫瘤縮小及提高宿體免疫功能。國內外已開發了多種香菇多糖制劑,如能治難、天地欣等。

        3.1治療肝炎

            香菇多糖配合其他藥物治療慢性乙型肝炎,可提高乙肝病毒標志物的轉陰作用,減少抗病毒藥物的副作用,降酶作用快而且穩定。在臨床應用中證明,香菇多糖加干擾素用于控制慢性乙型肝炎,可達到滿意的療效。

        3.2治療癌癥

            在圍手術期將香菇多糖溶解于5%葡萄糖液中靜脈滴注,每次2 nlg,每周2次,連續用藥12~16 mg為1療程,結果有助于提高中晚期腫瘤患者術后NK,LAK細胞活性,促進LTR的恢復,也可恢復手術創傷引起的T細胞亞群分布異常,從而有利于改善患者的細胞免疫功能,促進患者手術后的恢復,延長癌癥患者的生存時間并提高其生存質量。肺癌患者在化療過程中加用香菇多糖,可明顯改善腫瘤患者的免疫狀態、生活質量以及生存率,尤其對小細胞肺癌患者的治療效果更為顯著。在化療前3 d,將2 nlg香菇多糖溶解于5%葡萄糖溶液250 mL中,靜脈滴注,每周2次,連續8周,則可以增強化療的療效,同時使患者的白細胞下降概率、胃腸毒性、肝功能損害及嘔吐發生等明顯降低,表明香菇多糖與化療并用,可以增效、減毒、增強患者機體的免疫功能等。

        3.3治療各種感染

            符耀華研究表明,糖尿病并發感染的患者在口服降糖藥或注射胰島素抑制血糖的同時,應用香菇多糖可改善機體全身狀況,增強機體免疫力,從而使感染得到有效控制,加快疾病的康復。

            應用香菇多糖沖劑治療反復呼吸道感染患兒60例,臨床觀察總有效率達96.7%,表明香菇多糖對反復呼吸道感染患兒有廣泛的免疫刺激作用。另據資料報道,香菇多糖注射液與抗生素合用,能有效防治反復呼吸道感染的發生。

        3.4治療其他疾病

        采用口服香菇多糖加二氧化碳激光治療尖銳濕疣,比單獨用二氧化碳激光治療的疾病復發率明顯降低?诜愎蕉嗵墙Y合皮膚處外用皮質類固醇制劑治療銀屑病,有效率達92.11%。

        4香菇多糖的制備

            香菇多糖多從子實體中提取,也有研究者用香菇下腳料提取多糖,潘繼紅等以香菇柄為原料,用蒸餾水、0.5%草酸銨溶液兩種提取劑提取香菇柄粗多糖,其提取率分別為0.103%,0.164%,表明香菇柄有一定的開發價值。

            香菇子實體生產周期長,產量及多糖提取率均較低。采用深層發酵技術培養香菇菌絲體,不僅發酵液中含有與子實體相同且含量更高的營養成分,且可利用農副產品作原料,成本低,周期短,易于大規模生產,已得到廣泛重視及應用。邵偉等采用液體發酵培養的方法獲得香菇發酵液(LEL),發酵液經離心收集菌絲體,并從菌絲體中提取胞內粗多糖(LEPI)。劉美琴等將從香菇菌絲體中提取的粗多糖,經DE52柱層析,得到均一的多糖成分,命名為LE。為了提高發酵過程中香菇多糖的產量,滕利榮等_21_通過正交設計法對香菇發酵培養基中氮源最佳配比進行探索,發現香菇多糖的產量在發酵130 h時最大,其濃度可達25.1mg/mL,經分離純化得到兩種組分的香菇多糖。鄭典元等L22j采用正交設計法研究了香菇菌絲液體發酵碳源對香菇多糖產量的影響,試驗發現,發酵生產香菇多糖的最佳碳源為6%葡萄糖,4%淀粉,2%蔗糖,添加淀粉作碳源有利于香菇菌絲生長發育和多糖的積累。孫永林等E23]在培養基中加入木質纖維素后,香菇胞外多糖含量最多可提升0.99 g/L。

            從子實體和發酵培養的菌絲體中分離的多糖分子結構有一定的差異。目前對香菇多糖研究較多的是一種商品名為Lentinan的β-(1→3)-D-葡聚糖。Shida等L241用3%三氯乙酸和1 mol/L NaOH溶液,從香菇子實體中分別提取出一種雜半乳糖和β-(1→3)-D-葡聚糖。Tomati等將從發酵香菇菌絲體中得到的香菇多糖進行一維及二維NMR分析,確定兩種多糖分別為木聚糖及葡聚糖。

        5  香菇多糖的提取純化

            多糖的分離提純涉及兩個方面:(1)將多糖與低分子有機物、無機鹽等成分分離,或者與蛋白質、酯類等高分子量的自然產物分離;(2)單一多糖的分離提純。

        5.1香菇多糖的提取

            香菇多糖一般采用不同溫度的水或稀堿溶液提取。在其浸提參數中,溫度是影響多糖提取的主要因素,另外浸提固液比、浸提時問等也均影響提取率。此外,還有其他的一些提取方法。曾智平等發現微波法的提取率高于傳統熱水法,并且縮短提取時間和減少能耗。念保義等127J研究了超聲波提取香菇多糖,發現將香菇粉末用功率為80 W的熱水超聲提取13 min,可以防止多糖降解和多糖活性的降低,并且能縮短提取時間,減小料液比,提高提取效率,降低生產成本。張欣等采取復合酶解法結合熱水浸提法提取香菇柄多糖,提取率達71.3%,是熱水浸提法的3.43倍,酶解的最適條件為pH 4.5、溫度46℃、提取時間80 min。Yap和Ng將水提醇沉后的香菇粗多糖在液氮中凍干,凍干物用熱水溶解,離心除去不溶物,上清液用等體積的95%乙醇在4℃下沉淀過夜,離心,將沉淀物凍干后得β-D-葡聚糖,其純度經糖柱分析后可達到87.5%,與傳統的方法相比這種方法更加省時、高效、成本低。

        5.2香菇多糖的純化

            常用的純化方法有:沉淀法、柱層析法、制備性高效液相法、制備性區域電泳法、超濾法等。目前多采用各種不同的凝膠層析柱色譜和離子交換柱色譜。

            凝膠色譜是一種分辨率低、載樣量少的分離技術,但方法簡單、快速。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(sepharose),以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑,使不同大小的多糖分子得到分離純化。離子交換色譜是通過載體表面帶電基團與樣品離子和淋洗離子進行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附,來實現色譜分離。不同多糖尤其是多糖與蛋白質結合在一起的復合多糖,在一定pH條件下所帶電荷不同,根據各多糖上電荷的差異來達到分離目的。燕航等L30 J將香菇多糖粗制品用DEAE-纖維素柱層析,經NaCl洗脫,得到6個香菇多糖級分A~F;然后用sephadex G-200柱進一步純化香菇多糖B級分,得到香菇多糖亞級分B-1和B-2。邵偉等E19]采用液體發酵培養的方法獲得香菇胞內粗多糖,再經DEAE柱層析和Supdex200凝膠層析到一種蛋白多糖復合物。劉美琴等將香菇粗多糖進行DE52柱層析,得到均一的多糖成分,其平均分子量為5.08×105。阮征等用香菇水提物,經過DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-200凝膠柱色譜得到均一多糖級分L-2A。

            超濾技術是一種膜過濾技術,其原理主要是篩分作用,其中分子大小是其分離的主要依據,但分子形狀和電荷也起著重要作用。利用膜的選擇性,通過在膜兩側存在的能量差而造成溶液中各組分通過膜的遷移速率的不同,實現非均相物系的分離。利用超濾分離技術,易獲得多糖粗品,得糖率高,工藝流程簡單,工序少,提取時間短。李志洲[321利用超濾膜分離裝置進行香菇多糖的提取分離,建立了香菇多糖提取液超濾過程修正凝膠極化模型,這種工藝的香菇多糖提取率達6.10%,多糖粗品含量在90%以上。鄭宗昆等采用螺旋卷式超濾器對香菇多糖進行提取研究,結果在此試驗范圍內,用微濾作預處理的好于離心法處理,用超濾溫度為250C,pH值接近浸提介質的pH值,超濾壓力為0.15~O.18 MPa,制得的香菇多糖純度達74.4%,回收率為79.6%。謝紅旗等采用截留分子量為50 kD和300 kD的兩種陶瓷膜,將預處理過的香菇料液分成三種不同分子量范圍的多糖。

        6  展望

            隨著分子生物學的發展和香菇多糖研究的不斷深入,科學家們已經開始在基因水平探討香菇多糖生物活性的機制。多糖生物活性與結構問的關系的研究還落后于核酸與蛋白質的研究。目前主要集中在香菇中β-(1→3)-D-葡聚糖的研究上,其他多糖組分與生物活性之間的關系還有待進一步的明確。目前多糖的提取率普遍不高,提高香菇多糖的提取率已成為多糖產品開發需要解決的一個關鍵問題。不僅可以考慮將多種提取手段結合起來優化提取工藝,還可以通過遺傳育種、基因重組、物種誘變等手段選育出高產多糖的香菇菌株,提高香菇的多糖含量,以增加多糖的提取率,降低生產成本。

            今后對lentinan和其他活性類多糖的研究主要著重于3個方面:(1)多糖生物活性的生理機制的探索。雖然研究和發表的文章很多,但其機理還沒有完全搞清楚,需要作進一步的探究;(2)多糖構效關系的研究。多糖是一種承載著巨大構相變量的生物大分子,可以傳遞細胞之間海量的生物信息,要完全闡明這個關系,單憑生物學的手段是遠遠不夠的,只有通過物理、計算機、數學、化學等綜合手段的應用,才能獲得突破性的進展和成果,這也必將對21世紀生命科學產生巨大的影響;(3)應用研究。通過化學手段對多糖分子進行改性,使其具有更多的生物活性或者強化已有的生物活性,能夠更廣泛地應用于臨床。

        呂國英,范雷法,張作法,潘慧娟

        (浙汀省農業科學院園藝研究所,浙江杭州310021)

        浙江農業學報2009.2

         
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